J.A.C.S | 基于化学类型和靶点的基因组挖掘以寻找一种新的细菌肽脱甲酰酶天然产物抑制剂

大家好，今天推送的文章是2025年6月发表在Journal of the American Chemical Society上的“Chemotype- and Target-Driven Genome Mining for a New Natural Product Inhibitor of Bacterial Peptide Deformylase”。

抗生素的使用会推动抗菌药物耐药性（AMR）的进化，而这种耐药性会限制任何一种药物的长期疗效，研发具有全新结构和作用靶点的抗生素至关重要。放线菌酮（actinonin），它是细菌肽脱甲酰基酶（PDF）的抑制剂，其活性依赖于一个异羟肟酸酯基团，该基团在体内具有毒性。大量细菌基因组的测序为 “基于靶点的天然产物发现” 提供了契机，通过挖掘生物合成途径，有望找到具备预期活性、但不含已知药效团的分子。本研究借助生物信息学手段，开展了一项对化学型敏感、且基于靶点的筛选。寻找不含保守金属螯合基团的细菌肽脱甲酰基酶（PDF）天然产物抑制剂。 本研究对 “γ- 诺宁类化合物”（gammanonins）的发现过程、异源表达、生物合成、全合成及活性；这类化合物是来自 γ- 变形菌门（Gammaproteobacteria）的放线菌酮同源物。

一、肽脱甲酰基酶（PDF）抑制剂候选生物合成基因簇（BGCs）的分析鉴定

利用ClusterScout 工具，对整合微生物基因组（IMG）数据库中超过13.5 万个已完成测序及注释的细菌基因组进行了检索。研究以非核糖体肽合成酶（NRPS）结构域为 “筛选锚点”，搜索与PDF 基因定位相邻的生物合成基因簇（BGCs）。初步检索获得158 个候选基因簇，通过排除孤立结构域、铁载体（siderophore）相关基因簇以及与基因组中唯一PDF 基因相邻的通路，进一步筛选得到73 个潜在目标基因簇。使用CORASON 工具将这些潜在目标基因簇归类为21 个不同的NRPS 生物合成基因簇家族，这些家族均携带定位相邻的PDF 基因，该PDF 基因可能是潜在的自我保护基因（图1b）。在这些家族中，18 个基因簇来源于高产抗生素的革兰氏阳性放线菌（Actinomycetes），另有1 个候选基因簇分别存在于革兰氏阴性蓝细菌（Cyanobacteria）、α- 变形菌门（Alphaproteobacteria）和γ- 变形菌门（Gammaproteobacteria）中。最具研究价值的潜在目标基因簇来自γ- 变形菌门（Gammaproteobacteria）涵盖弧菌属（Vibrio）与光杆状菌属（Photorhabdus）的多个物种。这一“最小通路” 包含以下核心组件：1 个聚酮合酶（PKS）模块、3 个非核糖体肽合成酶（NRPS）模块、1 个起始型磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPTase）、1 个通路特异性甲基转移酶（MT），且关键在于该生物合成操纵子中还嵌入了1 个肽脱甲酰基酶（PDF）基因（图1c）。该生物合成基因簇（BGC）的预测化学产物是一种 “聚酮延伸型三肽”：其结构与放线菌酮（actinonin）具有可比性，但不含异羟肟酸基团（hydroxamate）或其他金属螯合基团，将该通路特异性甲基转移酶（MT）用于NCBI BLAST 检索，结果在致病杆菌属（Xenorhabdus）与布伦纳氏菌属（Brenneria）中发现了更多完全相同的通路。已有研究表明该基因簇与弧菌属（Vibrio）内的种间抗菌活性相关，这暗示其可编码具有抗菌作用的分子。基于上述特征，选择对该生物合成基因簇（BGC）展开深入研究，以期发现一种新型、不含异羟肟酸基团的细菌肽脱甲酰基酶（PDF）抑制剂。

图 1

二、对来自γ-变形菌纲的候选菌株 BGC 进行研究

从德国微生物与细胞培养物保藏中心（DSMZ）获取了图比亚氏弧菌（Vibrio tubiashii）DSM 19142 菌株，并采用此前报道的培养与提取条件，该条件曾用于富集奥氏弧菌（Vibrio ordalii）12B09 菌株的生物活性成分。未检测到报道中该产物应有的紫外信号（300 nm），且相关研究从未报道过该产物的特征诊断质量数。由于图比亚氏弧菌（V. tubiashii）的基因敲除实验难以实现，选择在大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3) 衍生菌株BAP1中对该生物合成通路进行异源表达，以寻找与该基因簇相关的产物。将该生物合成基因簇（BGC）克隆到两个pET Duet 质粒中，利用可诱导的T7 启动子驱动每条 “合成组装线” 基因的表达，同时驱动共转录的肽脱甲酰基酶（PDF）基因与甲基转移酶（MT）基因的表达（图1c）。携带该重构通路的BAP1 大肠杆菌菌株在 M9 基础培养基中培养，经诱导后分别在 37℃、30℃或 16℃条件下过夜孵育。随后对培养物进行离心处理，分别提取所得细胞沉淀与上清液中的成分，并通过高分辨液相色谱质谱联用技术（HR-LCMS）进行分析。为鉴定与该生物合成基因簇（BGC）表达相关的代谢产物，利用全球天然产物社会分子网络（GNPS）平台，对图比亚氏弧菌（V. tubiashii）提取物与工程化大肠杆菌提取物进行比较分析。结果显示，当在16℃条件下诱导表达时，图比亚氏弧菌与BAP1 菌株中均存在一系列与GNPS 数据库中标注的“亮氨酸- 缬氨酸二肽”相关的肽类代谢产物（图1d、e）。这三种分子是经过不同修饰的三肽，在细胞上清液与细胞沉淀中的含量均极低。利用不对称光杆状菌（Photorhabdus asymbiotica）DSM 15149 菌株中匹配的生物合成基因簇构建了表达质粒，结果在该菌株中也检测到了相同产物，且含量同样较低。由于图比亚氏弧菌生物合成基因簇（BGC）在异源表达系统中的产量高于其天然宿主，且大肠杆菌采用化学成分明确的培养基（便于产物分离纯化），因此在后续所有实验中，均选择大肠杆菌作为该类产物的生产菌株。为确定哪种代谢物是目标生物合成基因簇（BGC）的终产物，添加了稳定同位素标记的甲硫氨酸与乙酸盐，这两种物质可分别揭示甲基转移酶（MT）与末端聚酮合酶（PKS）模块的参与情况。结果显示，所有代谢物中均检测到了标记的甲基基团，但仅在质荷比（m/z）为374.3 的[M+H]离子（对应代谢物1）中检测到了与PKS 相关的标记乙酸盐。通过对腺苷酸化结构域（adenylation domain）的底物预测，推测该类代谢物的组成为1个L - 亮氨酸（L-leucine）残基与2 个L - 缬氨酸（L-valine）残基，这一推测得到了质荷比为344.3 的[M+H]三肽（对应代谢物2）的二级质谱（MS/MS）分析结果的证实。为进一步验证该组成，采用固相肽合成法（SPPS）合成了一系列三肽变体，这些变体在不同位置分别含有亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸与N - 甲基缬氨酸。其中，N - 甲基-L - 缬氨酸- L - 缬氨酸- L - 亮氨酸的合成三肽与天然三肽（代谢物2）完全一致。此外，还检测到一系列次要离子（质荷比358.3 的[M+H]），二级质谱分析表明，这些离子对应缬氨酸被亮氨酸/ 异亮氨酸取代的三肽变体。为解析完整天然产物（代谢物1）的结构，培养、提取并处理了100 L工程化大肠杆菌生产菌株的培养物。将细胞沉淀与上清液的混合提取物通过体积排阻色谱与半制备型液相色谱- 质谱联用技术（semipreparative LCMS）进行分离，最终获得7.8 毫克代谢物2 与1.8 毫克代谢物1（图2a），所得量足以通过核磁共振（NMR）技术进行结构解析，代谢物2 的结构与我们合成的三肽完全匹配；而代谢物1 则具有 “聚酮延伸型亮氨酸二醇” 结构，该结构让人联想到司他汀（statine）残基的类似物 —— 司他汀醇。

图 2

三、化合物1的合成

首先通过固相肽合成法（SPPS）制备N - 甲基化二肽，再将其与司他汀醇（statinol）的特定异构体偶联。司他汀醇的合成遵循司他汀（statine）的已知合成路线，得到Fmoc-L - 司他汀乙酯（Fmoc-L-statine ethyl ester）的R/S 非对映异构体，该产物是合成过程中的关键中间体。通过对Mosher esters的核磁共振（NMR）分析，确定S 型异构体为主要产物。在分离得到每种非对映异构体后，经二次还原与脱保护反应，获得纯净的司他汀醇。将主要异构体（L-S - 司他汀醇）与制备的二肽偶联，所得产物的保留时间及二级质谱（MS/MS）碎片模式均与化合物1 完全一致（图2a）。

四、化合物1的生物合成解析

该生物合成基因簇（BGC）具有多个希望解析的特殊特征。其中最显著的是，其 α-N - 甲基化作用显然通过反式作用实现，这与几乎所有细菌非核糖体肽的合成机制形成鲜明对比，后者的 N - 甲基转移酶结构域通常以顺式作用形式嵌入非核糖体肽合成酶（NRPS）中。为研究甲基转移酶（MT）的底物偏好性，制备了每种中间体的 N - 乙酰半胱胺（SNAC）衍生物，并在体外表达、纯化该甲基转移酶，随后进行甲基化反应实验。液相色谱 - 质谱联用（LCMS）分析显示，该甲基转移酶无法催化单个氨酰基 - SNAC 底物的甲基化，而优先作用于酶结合型聚酮延伸三肽（图 2b）。当从表达质粒中移除甲基转移酶基因后，未检测到化合物 1、化合物 2 或未甲基化的化合物 2，仅检测到未甲基化的化合物 1。未甲基化化合物 2 的信号缺失表明，该三肽可能被细胞降解，或甲基转移酶的过表达导致化合物 2 从合成组装线中过早释放。接下来，研究了聚酮合酶（PKS）中串联酰基载体蛋白（ACP）结构域的功能。其中一个 ACP 结构域可能供顺式作用的 PKS 结构域使用，而另一个可能参与反式甲基化过程。将每个 ACP 结构域中的关键丝氨酸残基突变为丙氨酸后，仅观察到化合物 1 的产量下降，未检测到新的中间体—— 这表明这两个 ACP 结构域在功能上基本冗余。

五、化合物1的活性评价

尝试检测化合物1 的活性及生物合成基因簇（BGC）相关肽脱甲酰基酶（PDF）的作用。首先，从质粒中移除 PDF 基因并分析培养物提取物，以验证该基因是否参与生物合成。结果显示，移除 PDF 基因并未导致新中间体产生，仅对化合物 1 的产量有轻微影响。移除这一假定的 “自我保护基因”（PDF 基因）并未影响诱导后大肠杆菌的生长。为验证大肠杆菌是否对化合物 1 具有固有抗性，过表达并纯化了大肠杆菌 PDF 酶。实验采用体外终点法检测 PDF 酶从 N - 甲酰化三肽底物中释放伯胺的能力，该过程通过荧光报告分子荧光胺（fluorescamine）进行检测。结果显示，与放线菌酮（actinonin，阳性对照）不同，化合物 1 并未对大肠杆菌 PDF 酶表现出抑制活性。鉴于此前有研究报道该基因簇具有抗弧菌活性，且其操纵子中存在明显的自我保护基因，进一步检测化合物 1 是否能抑制弧菌属 PDF 酶。表达并纯化了基因簇相关 PDF 酶，以及来自图比亚氏弧菌（V. tubiashii）和厚壳蛤弧菌（V. crassostreae）的 “管家 PDF 酶”，其中厚壳蛤弧菌对该基因簇产物具有已知敏感性。但与大肠杆菌实验结果一致，化合物 1 未对这些弧菌 PDF 酶表现出抑制活性，为探究 “缺乏金属结合基团” 是否是化合物 1 无生物活性的原因，合成了 N - 羧甲基 - L - 缬氨酸 - L - 缬氨酸 - L-(S)- 司他汀醇（化合物 3），并重复抗菌活性与酶抑制实验。结果显示，这种修饰产物既未表现出显著的 PDF 酶抑制活性，也无抗菌活性。理论上，若以羧基 - S - 腺苷甲硫氨酸（Cx-SAM）替代 S - 腺苷甲硫氨酸（SAM）作为共底物，生物合成过程可能产生化合物 3；但在弧菌或工程化大肠杆菌的培养提取物中，均未检测到该化合物。此外，在基因簇诱导表达期间过表达 Cx-SAM 生物合成相关基因，也未能产生预期产物。综上，这些研究表明，无论是天然宿主还是异源表达宿主，均未产生该基因簇的生物活性产物。

六、 生物活性样品的代谢组学分析

为找到该基因簇所报道抗菌活性的对应分子，获取了原始产生菌株（奥氏弧菌V. ordalii 12B09）及其对应的基因簇敲除菌株。以厚壳蛤弧菌为指示菌进行 “点 lawn 实验”（spot-on-lawn assay）。野生型 12B09 菌株周围出现明显抑菌圈，而基因簇敲除菌株或图比亚氏弧菌周围均无抑菌圈（图 3a）。对 12B09 菌株培养物进行提取、高分辨液相色谱 - 质谱联用（HR-LCMS）分析及全球天然产物社会分子网络（GNPS）分析，发现一系列含量丰富、与化合物 1 相关但此前未检测到的分子（图 3b、c）。不对称光杆状菌（P. asymbiotica）培养物中也含有这些代谢物，但将相同基因在大肠杆菌中表达时，却未检测到它们。根据这些分子的质量推测，它们与化合物 1 的差异在于：末端基团为醛基（而非化合物 1 中的羟基）（对应化合物 4-5）。进一步分析表明，所有检测到的分子质量均可通过以下过程解释：活性 β- 羟基醛（化合物 6）自发脱水，以及细胞内醛还原酶将醛基转化为羟基（化合物 7）。

图 3

七 、Gammanonin 的发现与解析

为寻找与抗菌活性相关的产物，对奥氏弧菌（V. ordalii）12B09 菌株的提取物进行了反复分馏，并以厚壳蛤弧菌（V. crassostreae）为指示菌开展生物活性测定。抗菌活性仅与高分辨液相色谱 - 质谱联用（HR-LCMS）分析中观察到的单一峰相关（质荷比 372.3 [M + H]，对应化合物 4；图 3c）。在分离过程中，该分子缓慢转化为质荷比 354.3 [M + H]的离子，以及另一个保留时间更短、紧接在化合物 1 之后洗脱的质荷比 372.3 [M + H]离子。通过二维核磁共振（2D NMR）解析，该活性分子被确认为环状半缩醛（cyclic hemiaminal）—— 这一结构特性解释了其固有的反应活性，以及在 LCMS 分析中呈现的独特源内碎裂模式。鉴于其与放线菌酮（actinonin）的结构相似性及其来源于 γ- 变形菌门（Gammaproteobacteria），将这一新分子命名为Gammanonin（化合物 4，图 4）。

图 4

Gammanonin 的环状半缩醛结构让人联想到四氢异喹啉类生物碱，在这类生物碱中，该结构特征可作为共价亲电位点（electrophilic warhead） 发挥作用。为验证半缩醛的形成是否为自发过程，合成了线性醛（化合物 5）。固相肽合成（SPPS）以负载 Fmoc-L-(S)- 司他汀（Fmoc-L-(S)-statine）的温勒布酰胺树脂（Weinreb AM resin）为起始原料，先将肽链延伸至三肽结构，再通过氢化铝锂（lithium aluminum hydride）从树脂上切割，得到醛基形式的产物。高分辨液相色谱 - 质谱联用（HR-LCMS）分析显示，反应生成了线性醛（对应保留时间较早的质荷比 372.3 [M + H]离子，即化合物 5），同时还检测到推测的 α,β- 不饱和醛（化合物 6，质荷比 354.3 [M + H]），以及分子间羟醛缩合副反应产生的二聚体。环状半缩醛（化合物 4）仅为次要产物，这表明其生物合成过程至少部分可能是自发形成的。

八、Gammanonin 的生物活性 通过“生物活性导向分馏” 分离得到 Gammanonin（化合物 4）后，进一步检测其是否能抑制细菌肽脱甲酰基酶（PDF）。采用此前建立的体外终点法实验发现：Gammanonin 能有效抑制大肠杆菌（E. coli）、厚壳蛤弧菌（V. crassostreae）及图比亚氏弧菌（V. tubiashii）“管家型” PDF 酶的活性（图 5a–c）。剂量效应对比显示，Gammanonin（化合物 4）的抑制活性弱于放线菌酮（actinonin）；但在加入底物前，若将 PDF 酶与 Gammanonin 预孵育，抑制效果会显著增强—— 这一现象与 “共价作用机制” 相符（即 Gammanonin 通过与酶形成共价键实现抑制）。生物合成基因簇（BGC）相关的 PDF 酶（命名为 GamD）对 Gammanonin 表现出一定抗性（图 5d）。对 γ- 变形菌门 PDF 序列的系统发育分析显示，不同细菌来源的 GamD 基因形成一个独立分支，这与 “GamD 是为抵御 Gammanonin 而进化出的保护性蛋白” 的推测一致。

通过对比 PDF 酶序列还发现，GamD 中部分保守残基发生了突变，其中包括位于放线菌酮结合位点附近的氨基酸。在 γ- 变形菌门所有非 GamD 型 PDF 序列中均存在一个保守半胱氨酸，推测该位点可能是 Gammanonin 的作用靶点（与 Gammanonin 发生反应）。但实验表明，将该半胱氨酸突变为 GamD 中特有的缬氨酸后，并未使 PDF 酶获得对 Gammanonin 的抗性。

图 5